Nucleic acid probes and method for detecting Ureaplasma urealyticum

ABSTRACT

A method of detecting a nucleic acid sequence in  Ureaplasma urealyticum  serovar 3 includes the steps of isolating a specimen containing nucleic acid; and analyzing the specimen with an assay such as in situ hybridization, Southern blotting, single strand conformational polymorphism, restriction endonuclease fingerprinting (REF), PCR amplification, 5′ nuclease assay (TaqMan PCR), and DNA-chip analysis using the nucleic acid sequences SEQ ID Nos:1-181.

This application claims the benefit of provisional application No.60/073,189, filed Jan. 30, 1998.

GRANT REFERENCE

The subject invention was made with government support under a grantfrom the National Institutes of Health, Grant No. NIH-AI28279. Thegovernment has certain rights in the invention.

TECHNICAL FIELD

The present invention relates to the determination of the complete DNAsequence of Ureaplasma urealyticum (Uu) and to the use of novel genesand sequences as probes and primers for assays for use in the detectionand/or quantification of Uu in a sample.

BACKGROUND OF THE INVENTION

Ureaplasma urealyticum (Uu) is a Mycoplasma which was first discoveredin men with nongonococcal urethritis (NGU) in 1954. Approximatelytwo-thirds of adults have Uu as part of their normal flora. Uu has beenassociated with and suspected as a pathogen in adverse pregnancyoutcomes such as chorioamnionitis, intrauterine infection, and prematurebirths. Uu has also been diagnosed as the causative agent of neonataldiseases such as pneumonia, meningitis, and sepsis. Uu has also beenisolated in certain patients suffering from suppurative arthritis,especially those having hypogammaglobulinemia.

The primary mechanism of transmission of Uu is by sexual contact whichcan then be transmitted to neonates born to infected mothers.

The biology of Uu, which is a member of the Mycoplasma family, isunique. The Mycoplasma family is a family of wall-less bacteria whichhas descended from low G+C Gram positive bacteria. The Mycoplasma areincluded among the smallest free-living cells known. Additionally, theMycoplasma use an alternate genetic code wherein the codonUGA=tryptophan (trp) rather than a stop or termination codon.Additionally, the Mycoplasma are biochemically different in that theypossess no TCA cycle and most Mycoplasma require cholesterol for growth.

Ureaplasma urealyticum infections are commonly asymptomatic, it isimportant to have specific and sensitive methods for detecting theirpresence in a patient. Mycoplasmas including Ureaplasma urealyticum aresomewhat atypical organisms and are difficult and are complex toculture. It is difficult for clinical laboratories to perform cultureisolation of Mycoplasmas and consequently there are no relatively easyand inexpensive methods for diagnosing the presence of this bacterium.

Genetic probes and detection methods for detecting Mycoplasmas includingUreaplasma urealyticum have been developed. U.S. Pat. No. 5,843,667 toWeisburg et al. discloses various nucleic acid sequences which arecapable of hybridizing to rRNA and rDNA of Mycoplasma etiological agentsincluding Ureaplasma urealyticum. The nucleic acid probes disclosed inthe Weisburg et al. patent specifically hybridize to 16S rRNA or 16SrDNA of Ureaplasma urealyticum. Similarly, U.S. Pat. No. 5,728,522 toDel Vecchio et al. discloses a method for detecting Ureaplasmaurealyticum involving in vitro nucleic acid amplification by contactingUreaplasma urealyticum target nucleic acids with an oligonucleotidefragment consisting of a contiguous nucleotide of Ureaplasma urealyticumDNA inserted into the plasmid pCU3900 having ATCC Accession No. 97424.

Neither U.S. Pat. No. 5,843,667 nor U.S. Pat. No. 5,728,522 disclose theentire DNA sequence of Ureaplasma urealyticum serovar 3 and, in fact,only disclose small DNA and/or RNA sequences from Ureaplasmaurealyticum.

Therefore, in order to better understand the nature and effects ofUreaplasma urealyticum, as well as to more accurately and consistentlydetect and diagnose the presence of Ureaplasma urealyticum in apotential carrier and to better develop antibiotic drugs specificallyeffective against Ureaplasma urealyticum, which, consequently, has nocurrent antibiotic directed specifically against it, it would beadvantageous to isolate and determine the gene sequences and functionswhich are unique to Ureaplasma urealyticum and utilize these sequencesas a basis for detecting Ureaplasma urealyticum in a patient and therebybe able to more effectively treat those patients infected withUreaplasma urealyticum as well as to develop new and improved drugtherapies against Ureaplasma urealyticum.

SUMMARY OF THE INVENTION

A method of detecting a nucleic acid sequence in Ureaplasma urealyticumserovar 3 includes the steps of isolating a specimen containing nucleicacid; and analyzing the specimen with an assay such as in situhybridization, Southern blotting, single strand conformationalpolymorphism, restriction endonuclease fingerprinting (REF), PCRamplification, 5′ nuclease assay (such as the TAQMAN PCR method forquantification of PCR), and DNA-chip analysis using the unique nucleicacid sequence SEQ ID Nos:1-181.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

The present invention provides the sequence of the genome of thebacterium Ureaplasma urealyticum serovar 3 (Uu). Uu is an opportunisticpathogen of the human urogenital tract that is a significant cause ofadverse pregnancy outcome, neonatal disease, and suppurative arthritis.Uu contains a single circular chromosome having 751,719 base pairsdesignated SEQ ID No:182. Of these base pairs, only 25.5% of the basesare G or C. The Uu chromosome codes for approximately 600 genes. Asdiscussed above, Ureaplasmas use an unusual genetic code in which TGAcodes for tryptophan instead of for translation termination. Although 62codons for amino acid are represented in the Uu genome, only 30 tRNAsare coded for by the Uu genome. There are only two rRNA operons.

The present invention also consists of purified, isolated, and clonednucleic acid sequences encoding novel genes designated SEQ ID Nos:1-181.The nucleic acid can be genomic DNA, cDNA, or mRNA.

The invention further provides purified protein sequences as encoded bythe novel Uu genes and analogs and mutations thereof.

The present invention further includes the recombinant proteins encodedby the genes. These recombinant proteins are isolated and purified bytechniques known to those skilled in the art.

As used herein, the term “analog” is used to define a compound ormolecule which will be generally at least 70% homologous over anyportion that is functionally relevant. In more preferred embodiments,the homology will be at least 80% and can approach 95% homology to thenative protein. The amino acid sequence of any analog may differ fromthat of the native protein when at least one residue is deleted,inserted, or substituted but the protein remains functional. Differencesin glycosylation can provide analogs.

As defined herein, the term “nucleotide” is used to define a subunit ofnucleic acid consisting of a phosphate group, a 5′ carbon sugar, and anitrogen containing base. In DNA, the 5′ carbon sugar is a2-deoxyribose. For RNA, the 5′ carbon sugar is a ribose.

As used herein, the term “oligonucleotide” is defined as a nucleotidepolymer (at least two nucleotides linked by a phosphodiester bond).

As defined herein, the terms “nucleic acid probe” and “primer” are usedto define a single stranded nucleic acid sequence that will combine witha complementary single stranded target nucleic acid sequence to form adouble-stranded molecule or hybrid. In the case of the primer, thehybrid can be used to initiate replication such as with PCR.

As used herein, the term “hybrid” is used to define the complex formedbetween two single stranded nucleic acid sequences by standard basepairing.

As used herein, the term “hybridization” defines the process by whichtwo complementary strands of nucleic acids combine to form a doublestranded molecule or hybrid.

As used herein, the term “stringency” is used to define the temperatureand solvent composition existing during hybridization and the subsequentprocessing steps at which a hybrid comprised of two complementarynucleic acid sequences will form. Stringency also defines the amount ofhomology, the conditions necessary, and the stability of hybrids formedbetween target sequences and nontarget sequences.

The present invention also provides vectors comprising an expressioncontrol sequence operatively linked to the nucleic acid sequences of theUu genes and portions thereof as well as mutant sequences. The presentinvention further provides host cells, selected from suitable eukaryoticand prokaryotic cells, which are transformed with these vectors.

Using the present invention, it is possible to transform host cellsincluding E. coli, using the appropriate vectors so that they carryrecombinant DNA sequences derived from Uu genes. Such transformed cellsallow the study of the function and regulation of the particular genes.Use of recombinantly transformed host cells allows for the study of themechanisms of Uu gene function and, in particular, it will allow for thestudy of gene function and can be used in the development of antibioticsor other drug therapies useful against Uu.

Vectors are known or can be constructed by those skilled in the art andshould contain all expression elements necessary to achieve the desiredtranscription of the sequences. Other beneficial characteristics canalso be contained within the vector such as mechanisms for recovery ofthe nucleic acids in a different form. Phagemids are a specific exampleof such beneficial vectors because they can be used either as plasmidsor bacteriophage vectors. Examples of other vectors include viruses suchas bacteriophages, baculoviruses and retroviruses, DNA viruses, cosmids,plasmids and other recombination vectors. The vectors can also containelements for use in either prokaryotic or eukaryotic host systems. Oneof ordinary skill in the art will know which host systems are compatiblewith a particular vector.

The vectors can be introduced into cells or tissues by any one of avariety of known methods within the art. Such methods can be foundgenerally described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992). Also, nucleicacids can be introduced by, for example, stable or transienttransfection, lipofection, electroporation and infection withrecombinant viral vectors. Introduction of nucleic acids by infectionoffers several advantages over the other listed methods. Higherefficiency can be obtained due to their infectious nature. See also U.S.Pat. Nos. 5,487,992 and 5,464,764. Moreover, viruses are veryspecialized and typically infect and propagate in specific cell types.Thus, their natural specificity can be used to target the vectors to aspecific cell type in vivo or within a tissue or mixed culture of cells.Viral vectors can also be modified with specific receptors or ligands toalter target specificity through receptor mediated events.

Recombinant methods known in the art can also be used to achieve thesense, anti-sense or triplex inhibition of target nucleic acid. Forexample, vectors containing anti-sense nucleic acids can be employed toexpress protein or anti-sense messages to reduce the expression of thetarget nucleic acid and therefore its activity.

According to the present invention, there is also provided a method fordiagnosing and detecting Uu in a subject. Carrier detection isespecially important in diagnosing and treating those individuals orpatients which may be infected with Uu. Identifying those infected bythe presence of Uu specific nucleic acid sequences can lead to earlierdiagnosis and treatment.

The methods for diagnosing and detecting Uu in a subject generallycomprise the steps of obtaining a sample from a test subject, isolatingthe appropriate test material from the sample and assaying the samplefor the target nucleic acid sequences or gene products. The sample canbe tissue or bodily fluids from which genetic material and/or proteinsare isolated using methods standard in the art. For example, DNA can beisolated from fluid or cells obtained from a vaginal swab.

More specifically, the method of Uu detection is carried out by firstobtaining a sample of either cells or bodily fluid from a subject.Convenient methods for obtaining a cellular sample can include swabbingor fluid collection. Crude DNA samples can be isolated from the cells(or alternatively proteins isolated) by techniques well known to thoseskilled in the art. This isolated target DNA is then used for PCRanalysis (or alternatively, Western blot analysis for proteins) withappropriate primers derived from selected Uu gene sequences such as SEQID Nos:1-173 by techniques well known in the art. The PCR product wouldthen be tested for the presence of Uu specific sequences or variationsthereof in order to diagnose and detect Uu in the subject.

The specimen can be assayed for polypeptides/proteins byimmunohistochemical and immunocytochemical staining, ELISA, RIA,immunoblots, Western blotting, immunoprecipitation, functional assaysand protein truncation tests. In preferred embodiments, Westernblotting, functional assays, and protein truncation tests will be used.mRNA complementary to the target nucleic acid sequences can be assayedby in situ hybridization, Northern blotting and reversetranscriptase-polymerase chain reaction. Nucleic acid sequences can beidentified by in situ hybridization, Southern blotting, single strandconformational polymorphism, PCR amplification and DNA-chip analysisusing specific primers.

ELISA assays are well known to those skilled in the art. Both polygonaland monoclonal antibodies can be used in the assays. Where appropriate,other immunoassays, such as radioimmunoassays (RIA) can be used as areknown to those in the art. Available immunoassays are extensivelydescribed in the patent and scientific literature. See, for example,U.S. Pat. Nos. 3,791,932, 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987;3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345;4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771; and 5,281,521 as well asSambrook et al., 1992. The Uu gene sequences SEQ ID Nos:1-173 can beexpressed using protein expression technology such as generallydescribed in Sambrook et al., 1992. Those Uu proteins expressed usingrecombinant DNA technology can be used in ELISA or Western blot assaysfor serological based detection of Uu in patient samples. Theaforementioned Uu proteins can also be used to generate monoclonalantibodies that could be used in the detection of Uu.

In order to use the method of the present invention for diagnosticapplications, it is advantageous to include a mechanism for identifyingthe presence or absence of target polynucleotide sequences (oralternatively proteins). In many hybridization based diagnostic orexperimental procedures, a label or tag is used to detect or visualizefor the presence or absence of a particular polynucleotide sequence.Typically, oligomer probes are labeled with radioisotopes such as ³²P or³⁵S (Sambrook, 1992) which can be detected by methods well known in theart such as autoradiography. Oligomer probes can also be labeled withnon-radioactive methods such as chemiluminescent materials which can bedetected by autoradiography (Sambrook, 1992). Also, enzyme-substratebased labeling and detection methods can be used. Labeling can beaccomplished by mechanisms well known in the art such as end labeling(Sambrook, 1992), chemical labeling, or by hybridization with anotherlabeled oligonucleotide. These methods of labeling and detection areprovided merely as examples and are not meant to provide a complete andexhaustive list of all of the methods known in the art.

The introduction of a label for detection purposes can be accomplishedby attaching the label to the probe prior to hybridization.

An alternative method for practicing the method of the present inventionincludes the step of binding the target DNA to a solid support prior tothe application of the probe. The solid support can be any materialcapable of binding the target DNA, such as beads or a membranousmaterial such as nitrocellulose or nylon. After the target DNA is boundto the solid support, the probe oligomers are applied.

The present invention also provides a kit for diagnosis and detection ofUu in a subject. The kit can include a molecular probe complementary tospecific genetic sequences found only in Uu and suitable labels fordetecting hybridization of the molecular probe and the specific Uu genethereby indicating the presence of Uu. The molecular probe has a DNAsequence complementary to the targeted Uu sequence. Alternatively, thekit can contain reagents and antibodies for detection of specific Uuproteins. The above discussion provides the factual basis for the useand identification of Uu, Uu genes, and Uu gene products and theidentification and detection of those infected with Uu.

Materials and Methods

General Methods in Molecular Biology:

Standard molecular biology techniques known in the art and notspecifically described were generally followed as in Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory,New York (1992).

Ureaplasma urealyticum serovar 3 reference strain was obtained from E.A. Freundt (Institute of Medical Microbiology, University of Aarhus,Aarhus, Denmark). Uu was grown in 10B medium until the media pH becamealkaline, the cells were concentrated in a phosphate buffered salinesolution by a combination of filtration and high speed centrifugation.Uu genomic DNA was extracted from the cell suspension using anInvitrogen EZ DNA kit according to the manufacturer's instructions forisolating DNA from Gram positive bacteria.

The Uu genomic sequence was obtained by a process developed for thisproject that is referred to as CROSS (Complete Random+Ordered ShotgunSequencing). In preparation for the complete random phase of thesequence analysis three different clonal libraries were prepared. Tomake a large insert library in lambda bacteriophage, Uu DNA waspartially digested using the restriction enzyme Sau 3A and fragmentscontaining between 7,000 and 11,000 base pairs were ligated into aNovagen Bluestar lambda vector according to the Novagen Lambda BluestarVector System instructions. Individual phage clones grown in E. coliwere collected in to a TM solution to stabilize the phage. The insertscontained in more than 1,500 individual Uu-lambda bacteriophage cloneswere amplified using XL-PCR according to the manufacturer's instructions(Perkin Elmer XL-PCR kit) using universal T3 and T7 primers. The ends ofthe XL-PCR amplicons were sequenced by performing reactions in a AppliedBiosystems 877 Catalyst Robotic Workstation and analyzing the reactantsusing either an Applied Biosystems 373 or 377 Prism DNA Sequencingapparatus. Two small insert libraries containing Uu DNA inserts weremade by ligating Uu fragments sheared to between 1,000 and 2,000 basepairs using nebulization or digested using either Rsa I, Alu I or Sau 3AI to between 1,000 and 2,000 base pairs. Inserts were ligated into thecloning vector pUC18. The plasmids were then ligated into E. coli.Sequencing templates were generated from bacteria containing Uu insertsin plasmids by the method of colony PCR. The ends of those DNA templateswere then sequenced using M13-40 forward and reverse primers byperforming reactions in a Applied Biosystems 877 Catalyst RoboticWorkstation and analyzing the reactants using either an AppliedBiosystems 373 or 377 Prism DNA Sequencing apparatus. After obtainingapproximately 2,400 DNA sequencing reads from the large insert lambdabacteriophage library and 7,600 DNA sequencing reads from the smallinsert plasmid libraries, the data were assembled using the DNA sequenceassembly software Autoassembler 1.4 (PE-Applied Biosystems). Gapsremaining in the genomic sequence were filled by an ordered phase whichwas a mix of “genomic walking” and “ordered shotgun sequencing”. Thosegaps in the sequence that were small were closed by either making a PCRamplicon that crossed the gap to use as a DNA sequencing template, orwere closed by sequencing using whole genomic DNA as a template (thelast method was developed as part of the Uu genome sequencing project,and is described in Heiner C. R., K. L. Hunkapiller, S. Chen, J. I.Glass, and E. Y. Chen. Sequencing multimegabase-template DNA withBigDye™ terminator chemistry PCR Methods & Applications. 8(5):557-6(1998). Large gaps or areas containing many small gaps were completedusing a method developed for “ordered shotgun sequencing” (Chen, E. Y.,Schlessinger, D. and Kere, J. Ordered shotgun sequencing, a strategy forintegrated mapping and sequencing of YAC clones. Genomics 17, 651-656(1993);Chen, C., Su, Y., Baybayan, P., Siruno, A., Nagaraja, R.,Mezzarella, R., Schlessinger, D, and Chen, E. Y. Ordered ShotgunSequencing of a 135 kb Xq25 YAC containing ANT-2 and four possiblegenes, including three confirmed by EST matches. Nucleic Acids Res. 24,4034-4041 (1996).) Briefly, a XL-PCR amplified insert from a large Uuinsert bacteriophage clone that spanned the gap or region of lowsequence quality was sonicated to generate Uu genome fragments between1,000 and 2,000 base pairs in length. Using colony PCR sequencing asdescribed earlier in this paragraph, 48 clones containing Uu insertswere sequenced and the new data was added to the assembly. All theassembled sequences were edited to remove low quality data and correctincorrect base calls made by the Applied Biosystems 373 and 377 PrismDNA sequencing software. Each of the 751,719 bases in the final assemblywas sequenced by at least two different high quality sequencingreactions.

Data checking and functional annotation of the Uu sequence was performedusing a system based upon compiling the results from Genemark searches(Borodovsky, M., McIninch, J., Koonin, E., Rudd, K., Medigue, C. and A.Danchin 1995. Detection of New Genes in the Bacterial Genome UsingMarkov Models for Three Gene Classes. Nucleic Acids Research, 23,3554-3562) for potential protein-coding genes, followed by BLASTsequence homology searches (Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997) “GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database searchprograms.” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) to determine matches toexisting genes and identify genes unique to Uu. This information wasthen loaded into a Microsoft SQL Server database that we have developedthat contains all Uu sequence and annotation information. The front-endfor this database is a web page that directly accesses the SQL Serverdata, and allows users to develop individualized queries that can beconstructed by setting desired options on a web form. This system is notonly used to query the similarity and alignment data, but is also usedin the direct annotation of the sequence. Web forms have been developedthat allow us to directly enter coordinate data along with geneidentification and similarity data into our annotation database.

The unique genes isolated, purified, and cloned which were derived fromUreaplasma urealyticum serovar 3. These sequences, designated SEQ IDNos:1-173, can be specifically utilized as probes or primers in thedetection and diagnosis of Uu infection in a subject by the methodsdescribed above. SEQ ID Nos:174-181 designate genes associated with theurease complex of Ureaplasma urealyticum. In terms of developing ordesigning an antibiotic specifically targeted at Ureaplasma urealyticum,the most logical genetic target or gene product target would be somecomponent associated with the urease gene complex.

Throughout this application, various publications and patents arereferenced by citation or number. Full citations for the publicationsreferenced are listed below. The disclosures of these publications intheir entireties are hereby incorporated by reference into thisapplication in order to more fully describe the state of the art towhich this invention pertains.

The invention has been described in an illustrative manner, and it is tobe understood that the terminology which has been used is intended to bein the nature of words of description rather than of limitation.

Obviously, many modifications and variations of the present inventionare possible in light of the above teachings. It is, therefore, to beunderstood that within the scope of the appended claims, the inventionmay be practiced otherwise than as specifically described.

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attttgaatttgaaatacct gaaaaccaaa aagaatcagt taaccaagat 1800 gttttaaata gtaatagtattgataatttt aaagaagaaa aagctaaaga aaatactttc 1860 ttaacaccaa aagaaatagaaaataatgat ttatcatcac aaattgaatt aacacctgct 1920 gattttgaac ttaagacacaagaaattaat gacgaaactg aacgtttatt ggatgaatta 1980 aataataata aacctaaagaaaagaagaaa ttttggacat gatttaactc aaaaaaaaga 2040 taa 2043

What is claimed is:
 1. A vector comprising nucleotide sequence SEQ IDNo:
 60. 2. A prokaryotic or eukaryotic host cell stably transformed ortransfected by a vector comprising nucleotide sequence SEQ ID No: 60.